細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：激酶抑制劑（Toceranib）

英文名稱：Toceranib

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8569

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 FOLR1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞丙二醛（MDA）含量比色法定量檢測(cè)試劑盒  50次

人 FOLR1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽（種系）體外卵母細(xì)胞成熟（in vitro maturation；IVM）培養(yǎng)液  100毫升

人 NEGR1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽卵母細(xì)胞凍存試劑盒  50次

人 NEGR1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽卵母細(xì)胞清理液  100毫升

人 CADM1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽（種系）體外卵母細(xì)胞成熟（in vitro maturation；IVM）  1毫升

人 CADM1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽培養(yǎng)生長(zhǎng)因子（20倍）  

人 BECN1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽卵母細(xì)胞核成熟苔紅素（orcein）熒光染色分析試劑盒  20次

人 S100A9 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽體外受精（in vitro fertilization IVF）細(xì)胞培養(yǎng)液  50毫升

人 TREM2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽胚胎組織培養(yǎng)液  500毫升

人 AGO2 / EIF2C2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽活力熒光染色試劑盒  50次

人 AGO2 / EIF2C2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽活力伊紅苯胺黑（eosin－nigrosin）染色試劑盒  50次

激酶抑制劑（Toceranib）RAP1GDS1  G蛋白GTP-GDP解離刺激因子1抗體 規(guī)格: 0.2ml

NME6/IPIA ALPHA  P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制蛋白α抗體 規(guī)格: 0.2ml

NEK8  絲/蘇蛋白激NEK8抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-human IgM/Alexa Fluor 647  Alexa Fluor 647標(biāo)記的小鼠抗人IgM 規(guī)格: 0.1mlBNP  腦鈉素/利鈉肽抗體 規(guī)格: 0.2ml

Goat Anti-human IgG/Cy3  Cy3標(biāo)記的羊抗人IgG 規(guī)格: 0.1ml

Rabbit Anti-Avidin/AP  堿性磷酸（AP）標(biāo)記的兔抗親和素 規(guī)格: 0.1ml

Phospho-TrkA (Tyr785)/TrkB (Tyr816)  磷酸化酪激A抗體 規(guī)格: 0.1mlphospho-AKT1/2/3 (Tyr315/316/312)   磷酸化蛋白激AKT1,2,3抗體 規(guī)格: 0.1ml

ENO1+ENO2+ENO3  神經(jīng)元，肌肉特異性烯醇化抗體 規(guī)格: 0.2ml

PAK7/PAK5/MBT  激活激PAK7抗體 規(guī)格: 0.2mlPhospho-PLC gamma 2(Tyr753)  磷酸化磷酯Cγ2抗體 規(guī)格: 0.1ml

Phospho-Numb (Ser276)  磷酸化膜相關(guān)蛋白Numb抗體 規(guī)格: 0.1ml

TECTB  遺傳性耳聾β-tectorin抗體 規(guī)格: 0.2ml