細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)

英文名稱：T56-LIMKi

產品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

產品貨號：BJ-01X8521

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

大鼠 IL27 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  10次

大鼠 IL21 基因全長ORF克?。⊿CHMORL）間接染色試劑盒  

大鼠 IL8RB 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  50次

大鼠 IL4R 基因全長ORF克隆（SCHMORL）直接染色試劑盒  

大鼠 IL2RG 基因全長ORF克隆細胞衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL1R2 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL25 基因全長ORF克隆全組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

大鼠 IL19 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 TNFRSF18 基因全長ORF克隆冰凍切片組織衰老晚期特異性脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL18R1 基因全長ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL17RA 基因全長ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)MYCBP2  MYC結合蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2ml

PNPT1  多核苷酸磷酸化蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

FOXO3A  叉蛋白O3A抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-MAX protein(Tyr123)  磷酸化Myc基因相關X因子抗體 規(guī)格: 0.1ml

PDHB  丙酮酸脫E1β亞單位抗體 規(guī)格: 0.2ml

C12ORF61  12號染色體開放閱讀框61抗體 規(guī)格: 0.2mlM2-PK/PKM2  小鼠抗丙酮酸激-M2抗體 規(guī)格: 0.1ml

Histone H3 (Di Methyl K27)  三甲基化組蛋白H3抗體 規(guī)格: 0.1ml

SMAD9  SMAD家族9抗體 規(guī)格: 0.2ml

AP2M1/AP-2?  接相關蛋白復合體AP-2μ鏈1抗體 規(guī)格: 0.2mlGTSE-1  G2期/S期應答相關蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-Guinea pig IgG/Bio  標記的小鼠抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

RAB40B  RAS基因家族蛋白RAB40B抗體 規(guī)格: 0.2ml

CRMP4/DRP3  腦衰蛋白反應調節(jié)蛋白4抗體 規(guī)格: 0.2ml