中文名稱：細(xì)胞分裂抑制劑(DM4)

英文名稱：DM4

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8485

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

大鼠 NGF 基因全長ORF克隆動物腫瘤組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 FLT3 基因全長ORF克隆人體NK細(xì)胞分離試劑盒  10次

食蟹猴 SEMA7A 基因全長ORF克隆結(jié)晶紫細(xì)胞群落染色試劑盒  250次

食蟹猴 THBD 基因全長ORF克隆細(xì)胞活力藍(lán)色熒光檢測試劑盒  50次

食蟹猴 PDGFRB 基因全長ORF克隆細(xì)胞活力臺盼藍(lán)染色試劑盒  100次

食蟹猴 KLRC1 基因全長ORF克隆中性紅細(xì)胞繁殖比色法定量檢測試劑盒  500次

食蟹猴 ITGA1 基因全長ORF克隆MTT比色法細(xì)胞繁殖測定試劑盒  500次

食蟹猴 ACE2 基因全長ORF克隆MTS比色法細(xì)胞繁殖定量檢測試劑盒  500次

食蟹猴 LIFR 基因全長ORF克隆PICOGREEN細(xì)胞繁殖定量檢測試劑盒  50次

食蟹猴 SEMA4D 基因全長ORF克隆G-B細(xì)胞活力和凋亡檢測試劑盒  50次

食蟹猴 LAMP2 基因全長ORF克隆G-B細(xì)胞活力和凋亡檢測試劑盒  50次

細(xì)胞分裂抑制劑(DM4)100uL 植物gamma-TIP PCR引物 Common PCR Primer -20℃保存

2 ug pMIB V5-His B pMIB V5-His B 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

月示蛋白胨 Proteose Peptone 250g

1瓶 SK-LU-1 [SKLU-1;SKLU1]細(xì)胞株 SK-LU-1 [SKLU-1;SKLU1] 低溫運(yùn)輸和保存

10mL 超級雜交液（芯片） SuperHyb Solution for Chip -20℃保存

100g 9,10- 二甲基 -1,2 苯并蒽 DMBA(9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracene) 常溫保存

50T 單增李斯特菌prfA基因(274bp)常規(guī)PCR檢測試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

1套 脂蛋白PAGE染液  

2 ug pYr-2.3- hH1（無熒光） pYr-2.3- hH1（無熒光） 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

10次 大提無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNAout Maxi Column Endo-free Plasmid DNAOUT 常溫保存(RNase A溶液4℃保存)

2 ug pET-41 Ek/LIC pET-41 Ek/LIC 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)