操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結(jié)果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) 中文名稱：PKH67/PI雙染細胞毒性檢測試劑盒 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：500T 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6512 PKH67/PI 雙染細胞毒性檢測試劑盒是利用細胞熒光染料PKH67和PI對細胞進行染色，利用PKH67標記靶細胞，PI標記死的靶細胞來區(qū)分不同的細胞，活的靶細胞成綠色，死的靶細胞成紅色和綠色，從而檢測細胞毒性作用。 根據(jù)不同的實驗方案設(shè)計，可以用來檢測化合物的細胞毒性作用。也可以用來檢測殺傷性T 細胞或NK 細胞介導的細胞毒作用。 熒光染料PKH67是一種可對活細胞進行熒光標記的新型染料，可以標記活體細胞，通過與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標記細胞。對細胞毒性較小，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細胞膜，有著強而穩(wěn)定的綠色熒光。經(jīng)PKH67標記的細胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會使鄰近細胞染色的功能。 在細胞分裂增殖過程中，PKH67的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等方面。PKH67標記細胞的熒光非常均一，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也更均一。在細胞分裂增殖過程中，PKH67標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，熒光強度變?yōu)橛H代細胞的一半，通過流式細胞儀根據(jù)熒光強度的不同，可檢測出未分裂細胞，分裂一次(1/2的熒光強度)，二次(1/4的熒光強度)，三次(1/8的熒光強度)，以及更多分裂次數(shù)的細胞。PKH67可檢測分裂次數(shù)多達六次甚至更多。 除了用于細胞增殖檢測，PKH67 還可以用于細胞的體外盒體內(nèi)示蹤，標記后熒光在胞內(nèi)表達穩(wěn)定，陽性標記率達98%以上，標記細胞形態(tài)良好，能有效地觀察細胞在體外的誘導分化情況；或?qū)擞浀募毎⑷塍w內(nèi)，可以有效的顯示移植細胞在活體組織中的遷移及分化。 PKH67標記的細胞用于體內(nèi)觀察可以長達數(shù)周之久，它常被用來做活體細胞檢測實驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的實驗。PKH67 毒性較小，不影響細胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患。可以更快速，更準確和更安全地得到想要的實驗數(shù)據(jù)。 PKH67/PI標記細胞后通常用流式細胞儀進行細胞毒性檢測。 PKH67標記細胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=490 nm,λem=502 nm。流式檢測時的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時的發(fā)射波長為502nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。PI標記細胞呈紅色熒光，流式檢測時的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時的發(fā)射波長為647nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL2 detection channel。 PKH67標記的細胞除了流式細胞儀檢測細胞毒性外，還可單染后用于細胞增殖檢測，或者用熒光酶標板定量活細胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進行均一染色的細胞示蹤觀察。 儲存條件：-20℃避光保存。 |
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備： 1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 Cyprinid Herpesvirus(CyHV-II)鯉皰疹病毒2型LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Equine Adenovirus(EAdV)馬腺病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Schistosoma mattheei,羊血吸蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Schistosoma curassoni柯拉松血吸蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Caulis lonicerae忍冬藤PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Avian Encephalomyelitis Virus(AEV)禽腦脊髓炎病毒RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1M-G)人免疫缺陷病毒1型M群G型RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Ostertagia ostertagi奧斯特奧斯特線蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Fructus oryzae germinatus稻芽LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Staphylococcus spp.葡萄球?qū)偻ㄓ肔AMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Fonsecaea compacta緊密著色霉LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Xanthomonas campestris pv. ricini野油菜黃單胞蓖麻致病變種PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 PKH67/PI雙染細胞毒性檢測試劑盒人抗二氫相關(guān)蛋白5(DPYSL5/CRMP5)抗體免疫試劑盒進口、組裝 PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：500ml*20瓶 人多免疫球蛋白受體(poly-IgR)免疫試劑盒進口、分裝 R3增殖培養(yǎng)基 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：250g 人SPARC相關(guān)模塊化鈣結(jié)合蛋白2(SMOC2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應 豬可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2/sFLK-1)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應 犬雌二醇(E2)免疫試劑盒進口、組裝 小鼠醇脫氫(SDH)免疫試劑盒進口、組裝 雞脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應 小鼠白血病抑制因子受體(LIFR)免疫試劑盒進口、分裝 大鼠血小板膜糖蛋白IIb(GPIIb)免疫試劑盒進口、分裝
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