細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱(chēng)：ES2細(xì)胞增殖抑制劑(Coumestrol)

英文名稱(chēng)：Coumestrol

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8539

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

大鼠 CD95 / Fas 基因全長(zhǎng)ORF克隆活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（過(guò)氧亞硝基陰離子）  20次

大鼠 CXCL2 / MIP-2 基因全長(zhǎng)ORF克隆真/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（過(guò)氧亞硝基陰離子）  20次

大鼠 CRP 基因全長(zhǎng)ORF克隆植物氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（過(guò)氧亞硝基陰離子）  20次

大鼠 CystatinC / CST3 基因全長(zhǎng)ORF克隆體液氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（過(guò)氧亞硝基陰離子）  20次

大鼠 CXCL1 基因全長(zhǎng)ORF克隆細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）比色法測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

大鼠 CCL5 基因全長(zhǎng)ORF克隆組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）比色法測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

大鼠 CCL4 基因全長(zhǎng)ORF克隆體液氧化應(yīng)激活性氧（ROS）比色法測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

大鼠 CCL20 基因全長(zhǎng)ORF克隆植物氧化應(yīng)激活性氧（ROS）比色法測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

大鼠 CCL2 / MCP-1 基因全長(zhǎng)ORF克隆單線態(tài)氧氣清除（scavenging）活性比色法篩選試劑盒  20次

大鼠 BOK 基因全長(zhǎng)ORF克隆細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

大鼠 CD62E / E-Selectin 基因全長(zhǎng)ORF克隆組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）熒光測(cè)定試劑盒（單線態(tài)氧氣）  20次

ES2細(xì)胞增殖抑制劑(Coumestrol)Phospho-CEBP alpha (Thr222/226)  磷酸化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CEBP α 抗體 規(guī)格: 0.1ml

Rabbit anti-mouse Kappa light chain/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5標(biāo)記的兔抗小鼠k鏈 規(guī)格: 0.1ml

Mouse Anti-Rabbit IgM/PE-CY5  PE-CY5標(biāo)記的小鼠抗兔IgM 規(guī)格: 0.1ml

phospho-PI3K p85/PIK3R1(Tyr368)  磷酸化磷脂酰肌醇激抗體 規(guī)格: 0.1mlIGSF16/CD300C  免疫球蛋白超家族成員16抗體 規(guī)格: 0.2ml

Rabbit Anti-Guinea pig IgM/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5標(biāo)記的兔抗豚鼠IgM 規(guī)格: 0.1ml

PACAP-38  苷酸環(huán)化激活肽-38抗體 規(guī)格: 0.1ml

SPY/CCDC99  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白99抗體 規(guī)格: 0.1mlDHRS7C  短鏈脫/還原家族7C抗體 規(guī)格: 0.2ml

GIMAP1  GTPIMAP家族成員1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Phospho-MAP2 (Thr1620/1623)  磷酸化微管相關(guān)蛋白2抗體 規(guī)格: 0.1ml

BIN1  橋連整合因子蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

phospho-Akt(Thr308)  磷酸化蛋白激B抗體 規(guī)格: 0.1ml