特點: 1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。 2. 根據(jù)細小病毒19保守序列設計的專一性引物,與相關病毒無交叉反應。 3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。 4. 一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續(xù)污染。 5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。 6. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。 儲存條件:-20℃以下,有效期12個月。 產(chǎn)品名稱 | 細小病毒19探針法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Parvovirus B19(PVB19)B19 ? | 貨號 | BJ-R7048 |
實驗過程: 一、試劑準備 1. DNA模板 2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步驟 1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。 2.調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。 3.結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。 4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。 三、注意事項 1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。設立一個的PCR實驗室。 2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡單越好。 3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。 4.PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。 5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。 6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。 7.PCR的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。 使用方法: 一、樣品采集: 1、食品樣品:樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照菌檢驗要求進行。 2、血液樣品:用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL,注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管,立即混勻。 3、糞便樣品:取糞便置于滅菌的收集管中送檢。 4、病灶部位樣品:取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。 一、稀釋 PCR 陽性對照(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例) 1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。 2. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。 3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。 4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。 5. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用 6. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。 7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 原理: 所謂實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 檢測方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。 SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖 PCR產(chǎn)物熔解曲線圖 2.TaqMan探針法: 探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。 木耳 Auricularia auricula三葉草瘤菌 Rhizobium trifolii NCI-H2170(人肺鱗細胞)5×106cells/瓶×2 人腦膜細胞*培養(yǎng)基100mL 中慢生華癸瘤菌 Mesorhizobium huakuii解脂亞羅酵母 Yarrowia lipolytica 彩虹預染中分子量蛋白Marker小鼠腸微血管細胞*培養(yǎng)基 苜蓿中華瘤菌豌豆瘤菌 Rhizobium leguminosarum 人腺導管細胞英文名稱:MDA-MB-435S 苯丙氨酸脫羧酶培養(yǎng)基/苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基/Phenylalanine Deaminase Medium用于細菌苯丙氨酸脫羧酶試驗100克國產(chǎn)/進口 植物桿菌 Lactobacillus plantarum粟酒裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 人臍靜脈平滑肌細胞尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 亮氨酰氨基肽酶(LAP)重組蛋白英文名稱:Recombinant Leucine Aminopeptidase (LAP) 細小病毒19探針法熒光定量PCR試劑盒WI-38(人胚肺細胞)人卵巢紫杉醇耐藥株 曲霉 Aspergillus niger釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 葡萄牙假絲酵母 Candida lusitaniae蘇云金芽胞桿菌蠟螟亞種 Bacillus thuringiensis subsp. galleriae 細胞程序性死亡蛋白6相互作用蛋白(PDCD6IP)重組蛋白英文名稱:Recombinant Programmed Cell Death Protein 6 Interacting Protein (PDCD6IP) 人表皮色素細胞*培養(yǎng)基HELF(人胚肺成纖維細胞) NCI-H446(人小細胞肺細胞)5×106cells/瓶×2gersion LS 180(人結腸腺細胞)5×106cells/瓶×2 肝細胞HBV病毒株英文名稱: 人肝細胞香菇屬 Lentinula sp. 苜蓿中華瘤菌植物桿菌 Lactobacillus plantarum Tissue Protein Extraction Kit/組織蛋白抽提試劑盒腺腺/阿霉素耐藥株 |