金葡菌特異性鑒別基因
 
    在金葡菌的檢測方面，近年來很多學(xué)者逐漸探索了一些有很強(qiáng)特異性的鑒別基因，主要包括如下幾種。
 
    a．耐熱核酸酶基因(heat stable nuelease，nuc)。耐熱核酸酶(thermostablenuclease，TNase)是金葡菌的特異性酶，通過檢測TNase酶活性以鑒定金葡菌通常有較好的專一性和準(zhǔn)確性，但也存在一些非金葡菌株可檢測到該酶活性的例子，其原因尚不清楚，可能是由于其可產(chǎn)生與TNase活性相似的酶。編碼酶蛋白的nuc基因已全部定序。通過nuc基因的特異擴(kuò)增來檢測金葡菌已被證實(shí)具有非常好的特異性，避免了檢測酶活時(shí)出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象，有很好的應(yīng)用前景。揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心高正琴、邢華等通過擴(kuò)增rlUC基因可以在4h內(nèi)檢測到zui低3pg DNA或5個金葡菌，并由此制備了特異性探針，檢測靈敏度達(dá)lpg DNA，符合率為100％。
 
    b．staphopainA／B。saphopains是一種與葡萄球菌致病性相關(guān)的、外分泌型半胱氨酸蛋白水解酶，包括蛋白水解酶A和蛋白水解酶B兩種，分別由基因scpA和sspB編碼。GolonkaE等通過PCR-RFLP技術(shù)對126株臨床分離金葡菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)所有菌株均檢測到這兩種基因的存在，且分別分為四型和六型。Southern雜交試驗(yàn)表明scpA和sspB基因在各菌株間高度保守，說明saphopains應(yīng)該屬于持家基因產(chǎn)物且具有重要的致病性能。
 
    c．血漿凝固酶(eoagulase)基因。大多數(shù)致病性葡萄球菌產(chǎn)生此酶，而非致病性菌一般不產(chǎn)生，因此，該酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。凝固酶有兩種：一種是分泌至菌體外的蛋白質(zhì)稱為游離凝固酶(free coagulase)；另一種結(jié)合于菌體表面并不釋放，稱為結(jié)合凝固酶(boundcoagulase)或凝聚因子(clumping factor)。游離凝固酶采用試管法檢測，結(jié)合凝固酶則以玻片法測定。凝固酶耐熱，粗制品加熱至100~C經(jīng)30rain或高壓滅菌后仍保持部分活性(staphylococcusbacteriaintroduce)；凝固酶基因曾被認(rèn)為是鑒定金葡菌的特異性基因，但后來發(fā)現(xiàn)有少數(shù)金葡菌并不產(chǎn)生凝固酶，且一些凝固酶陰性菌也有很強(qiáng)的致病性，且因具有過高的多態(tài)性而更多地應(yīng)用于金葡菌的分子分型技術(shù)。
 
    d．16SDNA、23SDNA及間隔序列23SRNA和168RNA分別為構(gòu)成核糖體大、小亞基的重要組分，它們的基因即23SDNA和16SDNA在分類學(xué)的種間有高度的保守性，?？捎脕碜鳛樘禺愋蛄需b定菌種屬。J．丸Straub等以23S DNA為靶基因，通過PCR技術(shù)檢測了肉類產(chǎn)品發(fā)酵劑及乳制品中的S．a(chǎn)ulelgs，通過選擇性前增菌過程，可在大量雜菌存在的背景下于12h內(nèi)檢測到10CFU濃度的目的菌，進(jìn)而通過嵌套PCR技術(shù)可使檢測極限下降一個數(shù)量級；翟俊輝等建立了以細(xì)菌16SDNA為對象的基因芯片技術(shù)，在4．5h內(nèi)的純細(xì)菌培養(yǎng)液中能檢測到235個菌體的金葡菌；同時(shí)，一種通過對168rDNA擴(kuò)增引物3’端單堿基錯配來鑒定S．a(chǎn)UreUS的策略也具有很好的效果。rRNA雜交試驗(yàn)在檢測金葡菌時(shí)表現(xiàn)出良好的特異性，但對臨床樣品的檢測中缺乏很好的靈敏性而限制了它的應(yīng)用。
 
    e．轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。D·Liu等報(bào)道了對S．a(chǎn)ureus中編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了兩個特異性片段Sa0836和Sa0856，并分別設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，結(jié)果表明該序列對S．a(chǎn)ureus具有明顯的特異性，可檢測所有待測的23株金葡菌，而其他類型葡萄球菌及常見菌均無此基因，表明該基因有很好的鑒別特異性。
 
    f．Sma I限制性酶切片段特異序列。一段44kb的Sma I序列被證實(shí)為金葡菌特異性序列。J．Stepan等將13株不同類型的金葡菌菌株基因組的EcoR工酶切片段與Sma工序列雜交，發(fā)現(xiàn)了在所有菌株中均存在一段2052bp的特異序列，通過設(shè)計(jì)引物，在待測的216株金葡菌中均特異性擴(kuò)增出826bp片段，而其他陰性對照菌均無該特異片段。
 
    g．基因組特異性插入片段。Francis Martineau等在廣泛分析了金葡菌基因組文庫后得到一段442bp的、編碼未知功能的特異性插入片段，通過PCR擴(kuò)增在所有待測82株金葡菌中，均表現(xiàn)出特異性結(jié)果，而在其他類型葡萄球菌及非葡萄球菌致病菌中均未擴(kuò)增，特異性強(qiáng)，操作簡便，耗時(shí)短(僅1h)。