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聯(lián)系我們科普酶標記抗體的兩種制備方法
點擊次數(shù)：534 更新時間：2023-05-08
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
1、戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標記抗體。
1、戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分 子間的比例不嚴格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。諏講椒ㄖ校?br>
2、過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物 酶的標記常用此法。反應(yīng)時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標記物按克分子比例聯(lián) 結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經(jīng)過徹di洗滌，游離 酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng) 予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只 能去除留在上清中的游離酶，但相當數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物 清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。
